[지재 판결문] 특허법원 2021허1424 - 등록무효(특)

 

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특 허 법 원
제 부
판 결
사 건 허 등록무효 특2021 1424 ( )
원 고 1. A

2. B

원고들 소송대리인 특허법인 아이퍼스
담당변리사 권구성
피 고 산학협력단C 
대표자 단장 D
소송대리인 특허법인 다나
담당변리사 김기정
변 론 종 결 2021. 10. 27.
판 결 선 고 2021. 12. 3.
주 문
- 2 -
원고들의 청구를 모두 기각한다1. .
소송비용은 원고들이 부담한다2. .
청 구 취 지
특허심판원이 당 호 사건에 관하여 한 심결을 취소한다2020. 12. 24. 2019 2371 .
이 유
기초 사실1. 
가 이 사건 특허발명 . 갑 제 호증( 3 )
발명의 명칭 1) : 바이오핀 1)
특허권자 2) : 피고 
출원일 등록일 등록번호 3) / / : 제 호 2011. 3. 15./ 2013. 8. 21./ 10-1300666
청구범위4) 
청구항 1【 】세포막 단백질 및 상기 단백질의 양 말단에 결합된 이상의 세포 침; 2 
투 펩타이드 를 포함하는 융합 단백질(cell-penetrating peptide, CPP) .
청구항 내지 청구항 기재 생략 2 19 ( )【 】 【 】
주요 내용 5) 
별지 기재와 같다 . 
나 당사자의 지위 등 . 
1) 본 명세서에서 바이오핀 은 생물학적 물질 예를 들어 세포를 고정하기 위한 융합 단백질을 말한다 특히 상기 바이" , biopin" , , . , 
오핀에 사용되는 두 가지 요소는 포유동물 세포의 특정 막단백질과 세포 침투 펩타이드로 이루어져 있고 세포의 특정 막단, 
백질이 머리부분을 상기 막단백질의 양 말단에 결합된 세포 침투 펩타이드는 각각 끝부분을 형성하는 핀 구조를 이루는 것, 
이다명세서 ( [0034]).
- 3 -
원고들은 피고 산학협력단 이하 피고 대학이라 한다 의 지도 교수인 소외 의 연구 C ( ’ ‘ ) E
실에 년 원고 및 년 원고 에 합류하였는데 이 사건 특허발명의 출원을 전2005 ( B) 2006 ( A) , 
후하여 위 연구실에서 박사과정에 있었다 피고 대학은 과 로부터 이 사건 특허발명의 . E F
특허를 받을 수 있는 권리를 양도받아 이에 대하여 특허등록을 받았다. 
다 이 사건 심결의 경위 . 
원고들은 피고를 상대로 특허심판원에 원고들은 이 사건 특허발명 1) 2019. 7. 23. “
의 공동 발명자에 해당하여 원고들이 발명자에서 배제되어 등록된 이 사건 특허발명은 
특허법 제 조 제 항 본문 및 동법 제 조를 위반한 경우에 해당하므로 동법 제 조 33 1 44 , 133
제 항 제 호의 무효사유를 갖는다 라고 주장하면서 이 사건 특허발명에 대한 등록무효심1 2 .”
판을 청구하였다. 
이에 특허심판원은 이를 당 호로 심리하여 원고들이 이 사 2) 2019 2371 2020. 12. 24. "
건 특허발명의 제조 및 실험에 일부 기초 실험에 참여한 것은 인정되나 이는 실험을 단, 
순 보조한 수준에 불과하여 이 사건 특허발명의 진정한 발명자로 볼 수 없으므로 이 사
건 특허발명은 특허법 제 조를 위반하였다 할 수 없다 라는 이유로 원고들의 심판청구44 .“
를 기각하는 심결을 하였다 이하 이 사건 심결이라 한다( ’ ‘ ).
인정 근거 다툼 없는 사실 갑 제 호증의 각 기재 변론 전체의 취지, 1, 2, 3 , 【 】
당사자의 2. 주장 요지
가 원고들. 
원고들은 이 사건 특허발명을 구상하고 그것을 구체화하기 위한 실험 및 결과를 도출 
하는데 참여한 발명자임에도 피고는 원고들의 동의 없이 소외 인만의 동의를 얻어 , E, F 2
특허를 받을 수 있는 권리를 양도받아 이 사건 특허발명을 출원하여 등록받았다 따라서 . 
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이 사건 특허발명은 피고가 공유자 전원의 동의를 얻지 않은 채 지분을 양도받아 출원한 
후 등록된 것으로서 무효사유가 있음에도 이와 달리 판단한 이 사건 심결은 위법하다.
나 피고 . 
원고들은 소외 의 지시에 따라 이 사건 특허발명의 일부 실험에 참가한 것에 불과할 E
뿐 이 사건 특허발명의 공동 발명자가 아니므로 이 사건 특허발명에는 원고들 주장과 같
은 무효사유가 존재하지 않는다. 
이 사건 심결의 위법 여부3. 
가 관련 법리 . 
인 이상이 공동으로 발명을 한 때에는 특허를 받을 수 있는 권리를 공유하고 그 2 , 
경우 공유자 전원이 공동으로 특허출원을 하여야 하며 특허를 받을 수 있는 권리가 , 
공유인 경우에는 각 공유자는 다른 공유자 모두의 동의를 받아야만 그 지분을 양도할 
수 있다 특허법 제 조 제 항 제 조 제 항 제 조( 33 2 , 37 3 , 44 )2) 이와 같은 규정에 반하여 등록. 
된 특허는 무효이고 이러한 등록무효 사유의 입증책임은 그 무효를 주장하는 자에게 , 
있다. 
한편 특허법상 발명자 공동발명자를 포함한다 에 해당한다고 하기 위해서는 단순히 , ( )
발명에 대한 기본적인 과제와 아이디어만을 제공하였거나 연구자를 일반적으로 관리하
고 연구자의 지시로 데이터의 정리와 실험만을 한 경우 또는 자금 설비 등을 제공하․
여 발명의 완성을 후원 위탁하였을 뿐인 정도 등에 그치지 않고 발명의 기술적 과제, ․
를 해결하기 위한 구체적인 착상을 새롭게 제시 부가 보완하거나 실험 등을 통하여 , ․ ․
새로운 착상을 구체화하거나 발명의 목적 및 효과를 달성하기 위한 구체적인 수단과 , 
2) 이 사건 특허발명의 출원 등록 이후 위 규정들에 대한 개정은 있었으나 실질적인 내용은 동일하다 , . 
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방법의 제공 또는 구체적인 조언 지도를 통하여 발명을 가능하게 한 경우 등과 같이 ․
기술적 사상의 창작행위에 실질적으로 기여하기에 이르러야 한다 대법원 ( 2012. 12. 27. 
선고 다 판결 대법원 선고 다 판결 등 참2011 67705, 67712 , 2011. 7. 28. 2009 75178 
조).
나 원고들을 이 사건 특허발명의 공동발명자로 인정할 수 있는지 여부. 
이 사건 특허발명에 대하여 등록무효 사유가 있는지와 관련하여 쟁점은 원고들을 , 
이 사건 특허발명의 공동발명자로 인정할 수 있는지 여부이므로 이에 관하여 본다. 
1) 갑 제 호증 변론 전체의 취지에 의해 진정성립 인정 갑 제 내지 4, 5, 7 ( ), 8 11, 13 
내지 호증 을 제 호증의 각 기재에 변론 전체의 취지를 종합하면 아래 각 사실이 인22 , 1
정된다. 
은 자신의 실험노트에 막단백질과 E 2008. 10. ’ PTD① 3) 또는 TAT4)를 융합시키
고 막단백질은 세포사멸을 일으키지 않아야 한다는 이 사건 특허발명이 기초하고 있, ‘
는 기술사상에 관한 메모를 하였고 을 제 호증 노트 쪽 그 이후 원고 은 ( 1 , 63 ), A 2010. 
부터 까지 의 지시를 받아 미국 소재 외부 업체1. 18. 2020. 6. 16. E (Bio-Synthesis Inc.)
로부터 OPRD(opioid receptor delta transmembrane domain)5) 연구에 사용할 펩타이 
드를 구입하였다.
은 소외 박사와 원고 에게 향후 연구 계획 이라는 제목의 E 2010. 10. 8. G A “ ”② 
메일을 보냈는데 그 메일에는 의 계획은 아래와 같아요 중략 의견 주세요, “OPRD ...( )... ”
3) 세포 침투 펩타이드 또는 단백질 전달체 는 이들과 화{cell-penetrating peptide(CPP)} {Protein Transduction Domain(PTD)}
학적 물리적 공유 또는 비공유 결합에 의하여 직접 또는 다른 매개체를 이용하여 간접적으로 연결된 특정 단백질 바이러스, , , 
지방 탄수화물 또는 화학적 화합물을 진핵 또는 원핵 세포의 세포질 또는 핵내로 전달가능한 물질 펩타이드를 DNA, RNA, , 
말한다 이 사건 특허발명 명세서( , [0036]). 
4) 인간 면역결핍 바이러스 타입 에서 유래한 단백질에 해당한다I(HIV-1) trans-activating transcriptional activator(Tat) .
5) 세포막 단백질로서 세포의 세포막에 걸려 세포막에 고정되는 특성을 가진다 , . 
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라는 내용과 함께 원고 에게 이 사건 특허발명이 기초로 하는 연구에 더 집중A OPRD 
하길 바란다는 취지의 요청을 하였다. 
원고 은 A 2010. 12. 29. ③ 세포막 단백질과 단백질의 양 말단에 결합된 이상의 2 
세포 침투 펩타이드 로 구성되는 융합 단백질에 의한 붉은색으로 염색된 실험용 쥐(CPP) , 
의 심장 근아세포 세포 와 녹색 형광 염료로 염색된 랫트의 (Rat cardiac myoblast H9c2 )
중간엽 줄기세포 에서의 세포간 결합 증가 효과에 관(ratmesenchymal stem cells, MSCs)
한 실험 결과가 기재된 문서를 작성하였다.
원고 은 부터 까지 과 펩타이드의 추가 구매 주문 A 2011. 1. 18. 2011. 1. 19. E④ 
과 관련하여 이메일을 통해 연락을 주고 받았고 갑 제 호증 으로부터 ( 10 ), 2011. 1. 19. E
차적으로 를 중심으로 양쪽에 를 위치시키는 것 등 이 사건 특허발명의 ’1 OPRD PTD ‘ 
융합 단백질에 관한 아이디어를 언급하는 내용이 담긴 이메일 수신인 참조인 원고 ( : G, : 
을 수신하였다 이후 원고 은 부터 까지 외부 업체A) . A 2011. 1. 2011. 8. (Bio-Synthesis 
로부터 펩타이드를 추가 구입하였다Inc.) .
원고들은 으로부터 라는 제목으로 이 사건 특허 E , 2011. 2. 15. ’BPin Project‘⑤ 
발명의 명세서에 도시된 도면을 요청하는 내용의 이메일을 받았고 이 사, 2011. 2. 22. 
건 특허발명과 관련한 연구 내용을 요약하는 내용의 를 작성해달라는 취지의 이메PPT
일을 받았다. 
원고들은 부터 까지 의과대학 이미징센터의 공초점 현미 2011. 11. 2013. 4. , C ⑥ 
경 의 사용승인을 신청하여 이를 사용하(Confocal Microscopy, Carl Zeiss L700, L710)
였다.
그러나 앞서 든 증거들 및 변론 전체의 취지를 종합하여 인정되는 다음과 같은 2) 
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사정에 비추어 보면 위 인정사실만으로는 원고들이 이 사건 특허발명의 공동발명자에 , 
해당한다고 보기 어렵고 달리 이를 인정할 증거가 없다, .
① 이 사건 특허발명의 기술사상은 막단백질과 의 역할을 하는 내지 펩타이pin PTD 
드를 융합함으로써 세포간의 고정을 이끌어 내어 실제 임상에서 줄기세포의 소실율을 감
소시키는 것으로 여기에서 라는 오피오이드 수용체가 그 막단백질로서 세포의 사멸, OPRD
을 일으키지 않아 세포 내지 조직의 보호에 효과적이라는 것이다 그런데 이러한 기술사, . 
상은 에 의해 최초로 착상되었고 이에 대해서는 원고들도 자인하고 있다 원2008. 10. E ( ), 
고들은 또는 와 가 결합된 구조는 원고들에 의해 도출되었다고 주장하 PTD CPP OPRD
나 위 구조의 도출이 원고들에 의해 착상 내지 제안되었다고 인정할 아무런 증거가 없
다. 
② 원고들은 이 사건 특허발명 관련 연구를 진행하는 과정에서 형광파장이 겹쳐 실
험결과를 제대로 하기 어려운 난관이 있었고 이를 극복하기 위해 공초점 현미경 판매 회
사 에 기술자문을 요청하여 설정을 변경하였다고 주장하나 설사 그러한 사실이 (Carl Zeiss) , 
인정된다고 하더라도 이는 단지 앞서 이 제시한 착상을 실험으로 구체화하기 위한 과정E
에서 발생하는 실험상의 단순 문제점을 해결한 것에 불과하고 이를 들어 , 원고들이 바이
오핀 융합 단백질 펩타이드의 설계 등을 하여 이 사건 특허발명의 기술적 과제를 해/ ‘
결하기 위한 구체적인 착상 및 발명의 목적 및 효과를 달성하기 위한 구체적인 수단’ ‘
과 방법의 제공 또는 구체적인 조언 지도를 하였다고 볼 수는 없다· ’ .
갑 제 호증 제 면에는 심장 근아세포 세포 에 4 1 (Rat cardiac myoblast H9c2 )③ 
펩타이드를 처리하고 이렇게 처리된 세포를 일정한 시간 배양OPRD , (1, 2, 4hr) 
한 후에 공초점 현미경으로 확인하는 내용의 실험이 기재되어 있고 갑 제(incubation) , 
- 8 -
호증의 제 면에는 펩타이드 및 를 다른 조건에서 세포에 처리4 2 OPRD (OP44 OP55) H9c2
한 후 형광 현미경으로 확인하는 실험의 내용이 기재되어 있으며 그 실험결과 사진이 , 
이 사건 특허발명의 명세서에 포함되어 있다 그러나 갑 제 호증의 각 기재만으로는 . 4, 5
위와 같은 실험이 의 지시에 의한 것이 아니라 원고들에 의해 독자적으로 수행된 것E
이고 나아가 그 실험에 의해 원고들이 이 사건 특허발명에 관한 새로운 착상을 구체, 
화하거나 발명의 목적 및 효과를 달성하기 위한 구체적인 수단과 방법을 제공하였다고 
단정할 수 없다. 
앞서 본 바와 같이 이 이 사건 특허발명과 관련된 새로운 아이디어를 착상 E④ 
하고 및 원고들에게 이메일을 통해 펩타이드를 이용한 실험방법 및 그에 따G OPRD 
른 실험결과의 정리를 지시한 바 있고 특히 은 자신이 착상한 바이오핀 펩타이드 합, E
성을 외부에 의뢰하는 과정에서 원고 에게 펩타이드의 구체적인 서열정보까지 명확A
히 제시하고 있는 등 실험 전반을 계획하고 구체적인 실험 방향을 지시하였다 따라서 . 
비록 위 실험의 세부적인 사항이 원고들에 의해 수행된 것이고 그 과정에서 원고들이 
특수 실험기기인 공초점 현미경을 사용하기 위해 이미징 센터의 실험기기 사용을 예약
하여 이를 사용하였고 그 실험결과 를 원고들이 보관하고 있다고 하더라도, (raw data) , 
그러한 사실만으로는 원고들이 이 사건 특허발명의 기술적 과제를 해결하기 위한 구체
적인 착상을 하였다거나 발명의 목적 및 효과를 달성하기 위한 구체적인 수단과 방법
을 제공하였다고 인정하기 어렵다.
반면 이 사건 특허발명 과정에서 작성된 실험노트 을 제 호증 에는 정지영이 ( 1 )⑤ 
막단백질로서의 의 선택부터 펩타이드 합성 또는 재조합 단백질OPRD (OP-44, OP-55) 
의 제조에 필요한 서열 디자인 등 바이오핀의 구조를 설계한 과정과 (OP-65, OP-76)
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그에 관한 구체적인 내용이 기재되어 있을 뿐 원고들이 그러한 바이오핀 구조의 설계, 
나 관련된 착상에 관여하였거나 실험 과정에서 난관에 봉착하여 그 해결책을 제시하거
나 실험조건을 변경하는 등의 방법으로 적극적으로 이 사건 발명의 목적 및 효과를 달
성하기 위한 구체적인 수단과 방법을 제공하였음을 인정할 아무런 기재가 없다 원고들(
은 위 연구노트 이외에 원고들이 이 사건 특허발명의 창작행위에 기여한 내용이 기재
되어 있는 연구노트가 추가로 작성된 바 있다고 주장하나 그와 같은 다른 연구노트의 , 
존재나 기재 내용을 알 수 있는 자료는 없다). 
다 소결. 
따라서 원고들이 이 사건 특허발명의 공동 발명자에 해당한다고 보기 어려운 이상 , 
이 사건 특허발명에는 원고들 주장과 같은 등록무효 사유가 인정되지 아니하므로 이와 
결론을 같이 한 이 사건 심결은 적법하다. 
결론4. 
그렇다면 이 사건 심결의 취소를 구하는 원고들의 청구는 모두 이유 없으므로 이를 
기각하기로 하여 주문과 같이 판결한다.
재판장 판사 김상우
판사 이혜진
판사 김영기
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별지
이 사건 특허발명의 주요 내용
기술분야 
본 발명은 세포막 단백질과 세포 침투 펩타이드로 이루어진 융합 단백질로서 세포 [0001] , 
전달 및 치료 세포의 추적 특정 조직 및 세포의 표적화 분자 영상 시스템 스텐트 등의 , , , , 
의료 도구에 대해 응용이 가능한 펩타이드성 바이오핀에 관한 것이다.
배경기술 
줄기세포 등의 다양한 세포전달에 의한 세포치료 기술은 재생의학 [0002] (stem cells) 
기술이 필요한 심장혈관 및 뇌 질환 등의 질환에 주요한 치료 방법으로 대두되고 있다 
(Hansson et al., 2009, Cell Stem Cell, 5, 364-377; Koch et al., 2009, Lancet Neurol., 8, 
실제 임상 적용 측면에서 중간엽 줄기세포819-829). (mesenchymalstem cells, MSCs), 
혈관전구세포 와 같은 성체 줄기세포 는 (endothelial progenitor cells, EPCs) (adult stem cells)
생체 내에서 분리 확보하기 쉽고 특정 세포로의 분화 능력도 갖추고 있어 실용화 가능성이 , 
높은 것으로 판단된다(Corselli et al., 2010, Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 1104-1109; 
특히 손상을 Kumar and Caplice, 2010, Arterioscler Thromb Vasc Biol., 30, 1080-1087). 
입으면 재생이 어려운 장기인 뇌 및 심장의 주요 질환인 심근경색 뇌졸중에 대한 다양한 , 
세포치료 임상시험과 함께 긍정적인 결과를 보이고 있다(Williams and Keating, 2008, 
그러나 현재까지 세포치료 기술의 한계 중 하나인 것은 전달된 Gerontology, 54, 300-311). 
세포 가 대상 장기 조직에 대한 부착률 이 에 지나지 않고(donor cells) , (attachment) 3~5% , 
전달 세포가 장기간 남아 있지 않아 장기적인 치료효과가 미미한 단점을 갖고 있다 
(Pittenger and Martin, 2004, Circ Res., 95, 9-20; Ryzhov et al., 2008, Circ Res., 102, 
이에 따라 전달하고자 하는 세포에 다양한 유전자를 전달하여 치료효과를 356-363). 
증진시키고자 하는 연구가 함께 진행되고 있으나(Sheyn et al., 2010, Adv Drug Deliv Rev., 
유전자 전달 벡터의 안전성 유전자 전달 시간 등의 고려가 있어야 하고 특히 62, 683-698) , , 
유전자 과발현 된 세포는 유전적으로 변형된 세포(overexpression) (genetically modified 
로 향후 세포 치료 임상 적용시 규제 대상이 될 가능성이 높아 이를 적용한 cells)
세포치료제 개발은 현실화되기 어렵다.
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발명의 내용 
본 발명의 목적은 세포간 접착의 증가를 유도하는 생체 연결용 펩타이드성 바이오[0003] 
핀 이의 제조방법과 세포전달 세포치료 진단 및 치료 시스템 등의 나노 바이오 소재로서, , , 
의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 [0004] , 
세포막 단백질 및 [0005] ; 
상기 단백질에 결합된 이상의 세포 침투 펩타이드[0006] 2 (cell-penetrating peptide, CPP)
를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
본 발명의 융합 단백질은 세포에 효과적으로 전달되고 세포간 결합을 증가시키는 바[0026] 
이오핀 으로서 약물 또는 세포전달 세포치료 분자영상 의료도구 등에 응용 가능함(biopin) , , , , 
으로써 진단이나 치료를 목적으로 하는 소재로서 유용하게 사용될 수 있다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 
이하 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다[0028] , .
본 발명은 세포내에서 생물학적인 변화를 예측하기 어렵고 부작용 우려가 있는 특정 [0029] 
유전자를 세포내로 전달하여 과발현 시키는 방법이 아닌 단순한 세포간 물리적 결합을 증가시
킬 수 있는 바이오핀 을 개발하고자 하였다(Biopin) . 
[0030] 일반적으로 세포전달 및 세포치료 기술에서 전달 세포가 대상 장기 조직에 대해 초기, , 
에 얼마나 효과적으로 부착되느냐에 따라 치료 효과가 달라질 수 있다. 특정 유전자의 과발현 
방법 또는 고분자 화합물을 이용해 전달세포를 효율적으로 대상 조직에 전달하려는 다양한 시
도는 이에 대한 반증이다 따라서 종래의 유전자 조작 방법 혹은 고분자를 이용한 세포 전달 . 
기술과 달리 전달 세포에 펩타이드성 핀을 꽂아 전달하려는 바이오핀의 개발은 세포전달 및 
세포치료와 이를 응용한 나노 바이오 분야의 소재로서의 가능성을 제시한다고 하겠다.
따라서 본 발명은 세포막 단백질 및[0031] , ; 
상기 단백질에 결합된 이상의 세포 침투 펩타이드 를 [0032] 2 (cell-penetrating peptide, CPP)
포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.
상기 융합 단백질은 세포막 단백질의 일 부분에 이상의 세포 침투 펩타이드가 결합[0033] 2 
한 구조를 가지며 보다 구체적으로 상기 세포 침투 펩타이드는 세포막 단백질의 양 말단에 , 
- 12 -
결합될 수 있다.
본 명세서에서 [0034] 바이오핀 은 생물학적 물질 예를 들어 세포를 고정하기 위한 " , biopin" , , 
융합 단백질을 말한다 특히 상기 바이오핀에 사용되는 두 가지 요소는 . , 포유동물 세포의 특정 
막단백질과 세포 침투 펩타이드로 이루어져 있고 세포의 특정 , 막단백질이 머리부분을 상기 , 
막단백질의 양 말단에 결합된 세포 침투 펩타이드는 각각 끝부분을 형성하는 핀 구조를 이루
는 것이다 보다 구체적으로 세포의 특정 막단백질을 가운데 위치시키고 이것의 세포 안쪽 . , , 
부위 와 세포바깥쪽 부위 양쪽에 세포 침투 펩타이드가 융합(intracellular site) (extracellular site) 
되도록 하여 제작된 융합 단백질을 바이오핀으로 명명하였다 상기 바이오핀을 세포에 (fusion) . 
전달하면 세포막에 위치하여 세포 안쪽 부위에 융합된 세포 침투 펩타이드는 세포 안쪽을 향
하게 되고 바깥쪽 부위에 융합된 세포 침투 펩타이드는 세포 외부로 노출되어 대상 세포 또는 
조직에 꽂히게 된다 도 첫 번째 그림 참조 외부로 노출된 핀이 대상 세포 또는 조직에 꽂( 1, ). 
혀 세포간 결합이 증가되는 것은 막단백질 세포 안쪽 도메인에만 세포 침투 펩타이드가 융합
된 형태의 융합 단백질을 세포에 전달하면 세포막에 위치하게 되지만 세포 외부로 노출된 세
포 침투 펩타이드가 없어 대상 세포 또는 조직에 꽂히지 않음을 통해 입증된다 도 두 번째 ( 1, 
그림 참조). 
도 1
- 13 -
상기 세포막 단백질은 포유동물 세포의 막단백질이라면 특별히 제한하지는 않으나 바[0035] , 
람직하게는, 트랜스멤브레인 도메인이 좋다 예를 들어 오피오이드 수용체 델타의 트랜스멤브. , 
레인 도메인 등을 포함한 세1{opioid receptor delta transmembrane domain 1(OPRD TM1)} 
포 사멸 등에 영향을 주지 않는 세포막 단백질이라면 특별히 제한하지 않는다.
상기 세포 침투 펩타이드 또는 단백질 전달체[0036] (cell-penetrating peptide(CPP) {Protein 
는 이들과 화학적 물리적 공유 또는 비공유 결합에 의하여 직접 Transduction Domain(PTD)} , 
또는 다른 매개체를 이용하여 간접적으로 연결된 특정 단백질 바이러스 지방 탄, , DNA, RNA, , 
수화물 또는 화학적 화합물을 진핵 또는 원핵 세포의 세포질 또는 핵내로 전달가능한 물질 펩
타이드를 말한다. 
상기 세포 침투 펩타이드는 특별히 제한하는 것은 아니나 인간 면역결핍 바이러스 타[0037] , 
입 에서 유래한 단백질 초파리의 안테나I(HIV-1) trans-activating transcriptional activator(Tat) , 
페디아 호메오도메인 인 또는 펩(Antennapedia Homeodomain) Antp(Antennapedia penetratin) 
타이드 쥐의 전사인자의 의 및 청어 프로타민의 를 사용할 수 있다, Mph-1, HSV-1 VP22 HP4 . 
또한 상기 세포 침투 펩타이드는 특정 세포 타입 또는 상태에 특이성을 갖는 세포 특[0038] , -
이적 를 포함할 수 있다 이러한 세포 특이적 의 한 예는 미국 특허공개 제PTD . - PTD
호에 기재된 합성 펩타이드이다2002-0102265 Hn1 . 
또한 상기 세포 침투 펩타이드는 합성 펩타이드일 수 있다 이러한 합성 펩타이드의 [0039] , . 
한 예는 등이 의 단백질이 단백질 전달 능력을 최적화하도록 단백질의 Ho HIV Tat Tat 47-57 
잔기를 변형한 펩타이드이다(Ho et al. (2001) Cancer Res 61(2):474-7).
본 발명의 구체적인 실시예에서 세포 침투 펩타이드는 의 서열[0040] , HIV Tat: YGRKKRRQRRR(
번호 를 포함하고 있다2) . 
본 발명의 일 구체예에 따르면 본 발명의 융합 단백질은 서열목록 서열번호 에 기재[0041] , 1
된 아미노산 서열의 양 말단에 서열번호 에 기재된 아미노산 서열이 결합되어 있는 형태일 2
수 있다.
본 발명의 융합 단백질은 펩타이드를 합성하는 당해 분야의 공지된 방법에 의하여 제[0042] 
조할 수 있다 예를 들어 유전자 재조합과 단백질 발현 시스템 또는 펩타이드 합성기 등을 통. 
하여 시험관내에서 합성하는 방법에 의하여 제조할 수 있다.
따라서 본 발명은 상기 융합 단백질을 발현하는 재조합 벡터를 제공한다[0043] , . 
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본 발명에서 재조합 벡터 란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터[0044] " "
로서 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전, 
자 작제물을 말한다.
본 발명은 또한 본 발명의 융합 단백질에 특이적으로 결합하는 다클론성 항체를 제공[0054] 
한다.
상기 다클론성 항체의 제조방법은 특별히 제한하지는 않으나 다음의 방법에 따라 제조[0055] , 
하는 것이 바람직하다. 
본 발명의 융합 단백질을 동물에 내지 수회 주사하여 면[0056] SPF(specific pathogen free) 1 
역화시킨다 최종 면역 후 일정 시간이 지난 뒤에 전혈하여 혈청만 취해 본 발명의 단백질에 . 
대한 다클론성 항체를 얻는다.
상기 면역화 동물은 통상 면역화에 사용되는 동물이면 특별히 제한하지 않으나 랫트인 [0057] , 
것이 바람직하다 상기 면역화를 위한 주사 횟수 기간 및 투여방법은 당업자 수준에서 변형 . , 
또는 변경가능하므로 특별히 제한하지 않는다.
실시예 재조합 방법에 따른 융합 단백질 바이오핀 의 제조[0114] < 1> ( )
발현 벡터[0115] pHis/TAT (Kwon JH et al., 2007, Biochem Biophys Res Commun., 363, 399-
를 이용하여 제조하였다 를 주형으로 하여 두 가지 프라이머404) . OPRD cDNA , Primer-1, 5'-TC
밑줄 부위 및 ACGTGGATCCCTGGCAATCGCCATCACCGCG-3'( BamHI ) Primer-2, 5'-AGGCATCTC
밑줄 GAGTTAGCGGCGGCGCTGGCGGCGTTTCTTGCGGCCGTAAGTGTACCGGACGATGCCGAA-3'( X
부위 를 이용하여 하여 단편을 얻고 각각의 제한효소 로 잘라 hoI ) PCR DNA , (BamHI/XhoI) pHis
발현 벡터에 넣어 대장균주 에서 발현한 후 를 /TAT BL21(DE3) Ni-NTA affinity chromatography
사용하여 단백질을 분리정제하였다 이렇게 되면 개의 아미노산으로 개 트랜스멤브레인 . 372 7
도메인으로 구성된 단백질의 첫 번째 도메인 부분인 번째 아미노산 루신 부터 OPRD 48 ( , L) 78
번째 아미노산 트레오닌 까지 개 아미노산으로 구성된 펩타이드를 중심으로 말단과 ( , T) 31 N- C-
말단에 각각 세포 침투 펩타이드가 융합된 바이오핀이 제조되었다 도 참조 이때 대조TAT ( 2 ). 
군으로 아미노산으로 구성된 펩타이드 한쪽에만 세포 침투 펩타이드가 위치하도록 31 OPRD 
제조하기 위해 을 밑줄 Primer-1 5'-TCGTCCCATATGGGATCCCTGGCAATCGCC ATCACC-3'( NdeI 
부위 로 대신하여 하여 같은 방법으로 제조하였다) PCR .
- 15 -
실시예 펩타이드 합성을 통한 융합 단백질 바이오핀 의 제조 [0116] < 2> ( )
본 발명의 융합 단백질은 펩타이드 합성기 를 이용하여 제조할 수 [0117] (peptide synthesizer)
있다 도 은 사 에 의뢰하여 펩타이드 합성기로 합성된 것으로 첫 . 3 Bio-Synthesis (USA) OPRD 
번째 도메인 양쪽에 세포 침투 펩타이드가 융합된 바이오핀 과 한쪽에만 융합된 (BPin-55)
를 제조한 서열을 나타낸 것이다BPin-44 .
실시예 형광물질로 표지한 바이오핀의 세포로의 전달 [0118] < 3> 
랫트의 심장 근아세포 세포를 웰 챔버[0119] (Rat cardiac myoblast H9c2(3×104 cells) 4-
에서 와 항생제가 첨가된 배지로 배양하(Lab-Tek chamber slide, Nunc, USA) 10% FCS DMEM 
였다 세포를 시간 동안 안정화를 시킨 후 세포 표지용 염료. 24 (VybrantTM DiI, Invitrogen, 
를 최종 의 농도로 처리하여 USA) 5 /mL 37 CO㎕ ℃ 2 배양기에서 분간 방치하였다 이후 30 . 
로 회 세척하여 준비하였다phosphate-buffered saline(PBS) 3 . 
두 종류의 바이오핀 도 참조 은 사 에 의뢰하여 [0120] (BPin-44, BPin-55, 3 ) Bio-Synthesis (USA)
합성하였다 바이오핀의 표지화는 다음과 같이 시행하였다 바이오핀 펩타이드. . (BPin-44, 
도 2
도 3
- 16 -
에 를 각각 처리하BPin-55) 0.1 mg Dylight 488 NHE-ester dye(Thermo, USA) 20.6 , 15.6 ㎕ ㎕ 
였다 실온에서 시간 반응시킨 후 투석 을 . 1 (Slide-A-Lyzer Mini Dialysis Units, Thermo, USA)
실시하여 표지되지 않는 형광염료는 제거하였다. 
위의 준비된 세포에 [0121] Dylight 488 NHE-ester dye로 표지화된 바이오핀을 최종 농1 M μ
도로 처리한 후 37 CO℃ 2 배양기에서 시간 동안 방치한 후 로 회 세척하였다 공초점 1 PBS 3 . 
현미경 에서 관찰하기 위해 세포 챔버에 처(Confocal Microscopy) mounting solution(3 drops) 
리한 후 공초점 현미경 을 사용하여 적색LSM700 (Carl Zeiss, Germany) VybrantTM DiI( ) (Abs 
549 nm/Em 565 nm), 녹색 파장으로 관찰Dylight 488 NHE-ester( ) (Abs 493 nm/Em 518 nm)
하였다. 
[0122] 도 에 나타난 바와 같이 두 종류의 바이오핀 모두 세포막에 위치하는 것을 확인하였4 , 
다.
실시예 바이오핀에 의한 세포간 결합 증가 효과< 4> 
랫트의 심장 근아세포 세포(Rat cardiac myoblast H9c2 )
를 웰 챔버 에 차도록 배4- (Lab-Tek chamber slide) 100% 
양하였다 세포 표지화 염료 를 최종 . - (VybrantTM DiI) 5 ㎕
의 농도로 처리하여 /mL 37 CO℃ 2 배양기에서 분간 반응시킨 후 로 회 세척하여 준비 30 PBS 3
하였다 랫트의 중간엽 줄기세포는 배지로 배양 접시에서 배양한 후 . MesenPRO(Gibco, USA) 
와 을 비율로 넣어 분간 처리하여 세포를 떼어내trypsin-EDTA trypsin-neutralizing solution 1:1 5
서 세포 표지화 염료 로 최종 의 농도로 처리하여 - (VybrantTM DiO, Invitrogen, USA) 5 /mL ㎕
37 CO℃ 2 배양기에서 분간 반응시킨 후 로 회 세척하고 으로 분간 원심 i 30 PBS 3 1,200 rpm 3
분리하여 준비하였다.
여기에 위의 실시예 또는 에서 준비된 융합 단백질을 최종 농도로 처리한 후 [0125] 1 2 1 M μ
37 CO℃ 2 배양기에서 시간 동안 좌우로 흔들면서 1
반응시킨 후 로 회 세척하고 원심분리하여 PBS 3 10% 
가 포함된 배지 처리하여 재현탁하FBS DMEM 400 ㎕
였다 이를 로 염색된 세포 위에 . VybrantTM DiI H9c2 
뿌리고 37 CO℃ 2 배양기에서 분간 방치하였다 이 10 . 
후 로 여러 번 세척하여 에 붙지 않은 PBS H9c2 MSCs
도 4
도 5
- 17 -
끝 - -
를 제거하고 형광현미경 형광현미경 을 사용하여 IX71 (Olympus, USA)
적색 녹색VybrantTM DiI( ) (Abs 549 nm/Em 565 nm), VybrantTM DiO( ) 
파장으로 각각 세포와 를 관찰(Abs 488nm/Em 501 nm) H9c2 MSCs 하였다. 
에 부착되어 있는 를 정량화하기 위해 세포 배지를 걷어내고 H9c2 MSCs
을 첨가한 후 분 후 걷어내 0.1% Triton X-100 200 5 Fluorescent ㎕ 
를 사용해 파장에서 Spectrometer Victor3(Perkin-Elmer, USA) 485/535 nm 
측정하였다. 
도 및 에 나타난 바와 같이 바이오핀 가 전달된 실험군에서 [0126] 5 6 , BPin-55 세포간 결합이 
현저히 증가되는 것을 확인하였다.
도 6